SRAP (z ang. Sequence-related amplified polymorphism - powiązany z sekwencją amplifikowany polimorfizm) - technika molekularna wykorzystująca PCR, polega na wykrywaniu zmian w otwartych ramkach odczytu (ORF), w związku z czym celuje w funkcjonalne geny. Ten system markerów został po raz pierwszy użyty i zademonstrowany przez Li i Quiros w 2001 roku.
Startery W tej technice wykorzystuje się dwa rodzaje starterów: Forward- po sekwencji „wypełniającej” następuje sekwencja CCGG Revers - po sekwencji „wypełniającej” następuje sekwencja AATT
Obydwa startery mają długość 17 lub 18 nukleotydów. Składają się z sekwencji rdzeniowej o długości 13 lub 14 nukleotydów z czego pierwsze 10 lub 11 od końca 5' nie posiada określonej konstrukcji, nazywamy te fragmenty sekwencją wypełniającą. Od końca 3' występują trzy selektywne nukleotydy.
Procedura Podobnie jak w przypadku techniki PCR w pierwszej kolejności przeprowadza się izolację DNA. Kolejnym etapem jest przygotowanie mieszaniny reakcyjnej, której przykład zamieszczony jest w tabeli: +Przykładowy skład mieszaniny reakcyjnej do SRAP-PCROdczynnikiObjętość (µl)Ilość w mieszaninieDNA360 ngH2O2,2 -Master Mix61xStarter F0,44 ngStarter R0,44 ng Po sporządzeniu mieszaniny przeprowadza się w termocyklerze reakcję SRAP-PCR. Przykładową reakcję przedstawia tabela: +Przykładowy profil termiczny reakcji SRAP-PCREtapTemperaturaCzasilość cykliWstępna denaturacja94 °C3 min.1xDenaturacja94 °C1 min.5xAnnealing35 °C1 min.Elongacja72 °C1 min.1xDenaturacja94 °C1 min.36xAnnealing50 °C1 min.Elongacja72 °C1 min.1xKońcowa elongacja72 °C7 min. W celu wizualizacji produktów reakcji i identyfikacji ewentualnych polimorfizmów przeprowadza się elektroforezę.
Zastosowanie SRAP SRAP-PCR jest techniką stosowaną w genetyce roślin uprawnych, do: charakteryzowania plazmy zarodkowej; identyfikacji odmian; mapowania molekularnego; klonowania genów roślin uprawnych; wykrywania zamian w ORF.
Zalety SRAP Do głównych zalet techniki SRAP-PCR można zaliczyć: małej ilość matrycowego DNA, niezbędna do przeprowadzenia reakcji; dobry poziom wykrywania polimorfizmu u wielu gatunków roślin; możliwość wykrywania markerów bez wcześniejszej wiedzy o sekwencji genomu; technika stosunkowo tania do wykonania; nie wymaga specjalistycznej aparatury.
Przypisy
Kategoria:Genetyka molekularna