thumb|350px|Budowa plazmidu Ti Plazmid Ti (, pTi) – plazmid występujący u patogennych gatunków rodzaju sensu lato, w tym u Agrobacterium tumefaciens, , Agrobacterium rubi i .
Z ewolucyjnego punktu widzenia plazmid Ti należy do rodziny plazmidów występujących u wielu gatunków alfaproteobakterii. Cechą charakterystyczną członków tej rodziny jest obecność konserwatywnego regionu DNA, zwanego kasetą genową repABC, który reguluje replikację plazmidu, jego segregację do komórek potomnych podczas podziału oraz utrzymanie plazmidu w komórce w niskiej liczbie kopii. Same plazmidy Ti dzieli się na różne kategorie w zależności od rodzaju cząsteczek, które bakterie mogą rozkładać w celu pozyskania energii.
Obecność plazmidu Ti jest niezbędna do wywoływania przez bakterie choroby guzowatości korzeni u roślin. Umożliwiają to kluczowe regiony plazmidu Ti, w tym region vir, który koduje geny wirulencji, oraz region transformującego DNA – fragment plazmidu przenoszony drogą koniugacji do komórek rośliny żywicielskiej po wykryciu miejsca uszkodzenia. Regiony te umożliwiają wprowadzenie T-DNA do komórek rośliny żywicielskiej i ich modyfikację w sposób prowadzący do syntezy związków, takich jak auksyny, cytokininy i opiny, oraz do powstawania guzów korzeniowych.
Charakterystyka Plazmid Ti należy do rodziny plazmidów RepABC występujących w alfaproteobakteriach. Plazmidy te mają często stosunkowo duże rozmiary – od 100 kpz do 2 Mpz. Często nazywa się je replikonami, ponieważ ich replikacja rozpoczyna się w jednym miejscu. Członkowie tej rodziny posiadają charakterystyczną kasetę genową repABC. Innym godnym uwagi przedstawicielem tej rodziny jest plazmid Ri () występujący u Agrobacterium rhizogenes; wywołuje on chorobę roślin zwaną włosowatością korzeni.
Odkrycie historyczne Zidentyfikowanie bakterii Agrobacterium tumefaciens jako przyczyny powstawania guzów korzeniowych u roślin utorowało drogę do zrozumienia molekularnych podstaw tej choroby.
Pierwsze przesłanki wskazujące na wpływ genetyczny na komórki rośliny żywicielskiej pojawiły się w latach 1942–1943, kiedy stwierdzono, że komórki roślinne guzów wtórnych nie zawierają komórek bakteryjnych; komórki te wykazywały jednak zdolność do wytwarzania opinów metabolizowanych przez zakażający szczep bakterii. Istotne jest, że synteza poszczególnych opinów przebiegała niezależnie od gatunku rośliny, a czasami jedynie w tkankach guzków; wskazuje to, że bakterie przekazały komórkom rośliny żywicielskiej materiał genetyczny umożliwiający syntezę opinów.
Jednak kwestia, w jaki sposób i w jakim stopniu dochodziło do transferu DNA, pozostawała otwarta. Samo wprowadzenie DNA Agrobacterium tumefaciens nie wywoływało nowotworów u roślin; stwierdzono, że do genomu komórki gospodarza zintegrowano jedynie niewielkie fragmenty DNA tej bakterii. Dodanie deoksyrybonukleaz (DN-az) w celu rozkładu DNA również nie zapobiegło powstawaniu i rozwojowi nowotworów roślinnych.
Następnie wykazano, że szczepy karcynogenne mogą przekształcać szczepy niepatogenne w patogenne drogą koniugacji, podczas której geny odpowiedzialne za wirulencję są przenoszone do komórek niepatogennych. Rola plazmidu w tej zdolności została potwierdzona przez stwierdzenie obecności dużych plazmidów wyłącznie w bakteriach patogennych, a nie w niepatogennych. Ostatecznie wykryto fragmenty plazmidów bakteryjnych w komórkach roślin-gospodarzy, co potwierdziło, że to ten materiał genetyczny odpowiada za genetyczny efekt infekcji.
Wraz z odkryciem plazmidu Ti przeprowadzono liczne badania mające na celu określenie cech tego plazmidu oraz mechanizmu przenoszenia materiału genetycznego z bakterii z rodzaju Agrobacterium do rośliny-gospodarza. Do najważniejszych wczesnych osiągnięć należą mapowanie plazmidu Ti w 1978 r. oraz analiza podobieństw sekwencji między różnymi plazmidami Ti w 1981 r.
W latach 1980–2000 prowadzono badania mające na celu scharakteryzowanie regionu T-DNA oraz regionu vir. Badania nad regionem T-DNA pozwoliły ustalić mechanizm jego transferu oraz zidentyfikować geny odpowiedzialne za syntezę hormonów roślinnych i opinów. W odrębnych, wczesnych badaniach starano się określić funkcje genów regionu vir; zwykle klasyfikowano je jako geny uczestniczące w interakcjach bakteria–gospodarz oraz jako geny biorące udział w przenoszeniu T-DNA.
Replikacja, podział i utrzymanie thumb|center|Kaseta genowa repABC plazmidów Ti w bakteriach z rodzaju Agrobacterium oraz schematyczne przedstawienie ich produktów genowych i aktywności Replikacja, podział i utrzymanie plazmidu Ti zależą od kasety genowej repABC, która składa się głównie z trzech genów: repA, repB i repC. Geny repA i repB kodują białka uczestniczące w podziale plazmidu, natomiast repC koduje inicjator replikacji. Geny te ulegają ekspresji pod kontrolą czterech różnych promotorów zlokalizowanych przed genem repA. Gen repE, kodujący mały antysensowny RNA, znajduje się między genami repB i repC. Ponadto w kasecie repABC znajduje się miejsce podziału parS oraz punkt inicjacji replikacji oriV.
Replikacja plazmidu Ti Replikacja plazmidu Ti jest kontrolowana przez białko inicjujące RepC, które ma dwie domeny białkowe: domenę N-terminalną (NTD) wiążącą DNA oraz domenę C-terminalną (CTD). Analizy mutacyjne wykazały, że bez funkcjonalnego białka RepC plazmid Ti nie replikuje się. Sekwencja oriV ma około 150 nukleotydów i znajduje się w obrębie genu repC. Eksperymenty wykazały, że białko RepC wiąże się z tym regionem, co sugeruje, że pełni on rolę punktu inicjacji replikacji.
Podział plazmidu Ti Elementy uczestniczące w systemie podziału plazmidów Ti, działających za pośrednictwem białek RepA i RepB Element Funkcja RepA (ParA) Słaba adenozynotrifosfataza, która ujemnie autoreguluje ekspresję kasety repABC i może tworzyć włókna ułatwiające podział plazmidu podczas podziału komórki. RepB (ParB) Białko wiążące DNA, pełniące rolę adaptera między RepA a miejscem parS parS Palindromiczne miejsce wiązania białka ParB o sekwencji konsensusowej GTTNNCNGCNGNNAAC System podziału plazmidu Ti jest podobny do systemu ParA i ParB występującego w innych plazmidach i chromosomach bakteryjnych; przypuszcza się, że działa na podobnej zasadzie. Mutacje w białkach RepA lub RepB prowadziły do obniżenia stabilności plazmidu, co wskazuje na ich rolę w procesie podziału. Zdolność białka RepA do tworzenia włókien umożliwia utworzenie fizycznego mostu, wzdłuż którego DNA może być przemieszczane do przeciwległych biegunów dzielącej się komórki; natomiast białko RepB specyficznie wiąże się z sekwencją parS, tworząc kompleks DNA rozpoznawany przez RepA.
Utrzymanie plazmidu Ti Plazmid Ti utrzymuje się w komórce bakteryjnej w niewielkiej liczbie kopii. Jest to częściowo związane z wpływem na ekspresję białka RepC, inicjującego replikację. Po związaniu ADP białko RepA ulega aktywacji i współdziała z białkiem RepB, pełniąc rolę negatywnego regulatora kasety repABC. W efekcie stężenie białka RepC w komórce pozostaje niskie, co zapobiega nadmiernej liczbie cykli replikacji podczas każdego podziału komórkowego. Ponadto w kasecie repABC znajduje się mały RNA zwany RepE, kodowany między genami repB i repC; obniża on poziom ekspresji genu repC. RepE jest komplementarny do mRNA repC i wiąże się z nim, tworząc dwuniciowy kompleks, który może hamować translację białka RepC.
Na ekspresję kasety repABC oraz na liczbę kopii plazmidu Ti oddziałuje również mechanizm quorum sensing u Agrobacterium. Mechanizm ten wykrywa gęstość populacji za pomocą autoinduktora – sygnałowej cząsteczki produkowanej przez komórki, której stężenie wzrasta wraz ze wzrostem gęstości bakterii. W tym przypadku autoinduktorem jest cząsteczka 3-O-C8-AHL, wykrywana przez regulator TraR. Po aktywacji TraR wiąże się z regionami promotorowymi kasety genowej repABC, pobudzając jej ekspresję. W związku z tym wysoka gęstość populacji powoduje wzrost liczby kopii plazmidu w każdej komórce bakteryjnej, co prawdopodobnie sprzyja patogenezie rośliny żywicielskiej.
Podobne plazmidy Plazmidy RepABC tworzą grupy niekompatybilności; plazmidy z tej samej grupy zazwyczaj nie mogą współistnieć, a jeden z nich prowadzi do eliminacji drugiego. Jednak wiele plazmidów Ti typu nopalinowego potrafi łączyć się z plazmidami niekompatybilnymi, co utrudnia ich usunięcie z bakterii – proces często stosowany w laboratorium do zastąpienia jednego plazmidu Ti innym.
Plazmid Ri Plazmid Ri () – termin opisowy odnoszący się do plazmidów patogennych podobnych do plazmidów Ti, które zamiast wywoływać guzowatość korzeni powodują włosowatość korzeni. Klasycznym przykładem jest plazmid Ri bakterii Rhizobium rhizogenes.
Plazmid pSym Plazmid pSym () – niektóre gatunki z rodzaju Rhizobium posiadają geny nif oraz nod zlokalizowane na chromosomie, podczas gdy inne przenoszą te geny na wyspecjalizowane plazmidy symbiotyczne (pSym). Podobnie jak plazmidy Ti, plazmidy sym wykorzystują mechanizm replikacji repABC, system quorum sensing TraI/TraR oraz system transferu trb. Typowym przykładem jest plazmid pNGR234a (536 165 bp) pochodzący od ; plazmid ten nie jest niezbędny do życia i nie pełni funkcji podstawowych. Katabolizm opinu odbywa się na chromosomie bakterii, natomiast system T4SS (VirB) znajduje się na megaplazmidzie, a nie na plazmidzie sym.
Przypisy
Kategoria:Biotechnologia Kategoria:DNA