W Polsce podczas kampanii wrześniowej w 1939 roku, oprócz zadań zwiadowczych i współpracy z artylerią używano ich do ostrzeliwania kolumn wojska i ludności cywilnej oraz bombardowań szlaków komunikacyjnych. W Polsce użyto około 250 samolotów Henschel Hs 126A, z czego 17 zostało zestrzelonych przez polskie lotnictwo. Samoloty te stosowano również w następnych latach II wojny światowej. Ponieważ jednak samolot tracił na swojej wartości bojowej od lata 1942 roku zaczęto go zastępować w jednostkach rozpoznawczych bliskiego zwiadu samolotem Focke-Wulf Fw 189. Pod koniec wojny w związku z doświadczeniami z radzieckimi samolotami Po-2 zaczęto stosować samolot Henschel Hs 126 do nocnych bombardowań linii frontu.
Samolotów tego typu użyto w operacji Eiche (akcja uwolnienia Mussoliniego) jako holowników dla szybowców DFS-230. Szybowcami lecieli komandosi z SS-Sonderverband z.b.V. Friedienthal pod dowództwem Hauptsturmführera Otto Skorzennego oraz strzelcy spadochronowi z batalionu I/7 (1 batalion 7 Pułku Strzelców Spadochronowych).