Wraz z utworzeniem Ligi Katolickiej, w której jej synowie odgrywali ważną rolę, jej znaczenie wzrosło. W grudniu 1588 Henryk III nakazał zamordować jej dwóch najstarszych synów, a samą Annę uwięzić. Po uwolnieniu dołączyła do rodziny w Paryżu i aktywnie uczestniczyła w politycznych akcjach Ligi Katolickiej.
Podczas oblężenia Paryża przez Henryka IV została ogłoszona przez Ligę Katolicką „królową-matką”. Po powrocie Burbonów do wiary katolickiej uznała Henryka IV za króla. Próbowała przekonać synów do tego samego. W 1594 wyjechała do Paryża, aby złożyć królowi hołd.
Spędziła swoje ostatnie lata jako superintendante de la maison (ochmistrzynią dworu) królowej Marii Medycejskiej. W chwili śmierci była księżną Nemours, Genevois i Chartres, hrabiną Gisors i damą Montargis, Caen, Bayeux i Falaise. Gdy zmarła, wartość jej majątku ruchomego szacowano na ponad 4000 liwrów. Jej wnętrzności i serce pochowano w Paryżu i Joinville, a ciało przewieziono do Annecy, gdzie złożono je obok drugiego męża. Żaden z grobowców nie zachował się.
Potomstwo Z małżeństwa z Franciszkiem de Guise: