W 1563 r., podczas wojny litewsko-rosyjskiej, po zajęciu Połocka przez cara Iwana Groźnego, obrońcy miasta wycofali się do Dzisny i na polecenie Zygmunta Augusta odbudowali fortyfikacje zamku, przywracając mu walory obronne, a król w 1569 roku nadał mieszkańcom przywileje prawne. Pracami kierowali Borkołab Korsak i Roman Chodkiewicz. Po zawieszeniu broni w lipcu 1566 r. Litwini wzmocnili obronność zamku z polecenia Grzegorza Chodkiewicza. W kolejnych latach zamek popadł w ruinę. lewo|mały|Wyspa Batorego na pocz. XX w. Za panowania Stefana Batorego następuje dalsze umocnienie i rozbudowa zamku. Przekopano kanał łączący Dzisnę z Dźwiną, przez co twierdza znalazła się na wyspie, zwanej odtąd Wyspą Batorego. Monarcha kilkakrotnie wizytował ją osobiście. Podczas wyprawy na Połock w 1579 roku miasto wybrano na jedną z głównych baz wojsk Rzeczypospolitej. Pod zamkiem wojska Batorego sprawnie przeprawiły się na wschodni brzeg Dźwiny po moście pontonowym, którego elementy sprowadzono z Wilna. Ponownie Batory był w Dziśnie w 1581 roku, gdzie Gotard Kettler złożył mu hołd, a Batory nadał mu inwestyturę. Po zakończeniu wojny z carem Iwanem Groźnym znaczenie militarne zamku ponownie zmalało.