Parker / Spider-Man, mentor Milesa Moralesa, który jest Spider-Manem z innego uniwersum. Hailee Steinfeld jako Gwen Stacy / Spider-Gwen, superbohaterka posiadająca pajęcze zdolności. Brian Tyree Henry jako Jefferson Davis, ojciec Milesa, policjant. Lauren Vélez jako Rio Morales, matka Milesa, pielęgniarka. Oscar Isaac jako Miguel O'Hara / Spider-Man 2099, alternatywna wersja Spider-Mana, podchodząca z przyszłości. Issa Rae jako Jess Drew / Spider-Woman, kobieta posiadająca pajęcze zdolności. Karan Soni jako Pavitr Prabhakar / Spider-Man India Daniel Kaluuya jako Hobie Brown / Spider-Punk Jason Schwartzman jako Spot, złoczyńca, którego ciało pokryte jest portalami do różnych wymiarów.
W wersji oryginalnej głosów użyczyli również: Rachel Dratch jako doradczyni zawodowa w szkole Moralesa; Shea Whigham jako George Stacy, kapitan policji i ojciec Gwen oraz Jorma Taccone jako Vulture, kryminalista.