Krytyka Galena spowodowała niechęć innych uczonych, w szczególności ataki ze strony byłego mentora Vesaliusa – Sylviusza. Vesalius zrezygnował z profesury w Padwie i przeniósł się do Brukseli, gdzie poślubił Annę van Hamme. W 1544 roku został nadwornym lekarzem Karola V; jego kariera jako lekarza rozwijała się bardzo dobrze. W 1556 roku został przez cesarza podniesiony do rangi hrabiego i otrzymał dożywotnią pensję. W 1559 roku przeniósł się do Madrytu na dwór Filipa II, króla Hiszpanii. W 1564 roku udał się w pielgrzymkę do Jerozolimy. Do dziś trwają spory badaczy, jaki był cel tej podróży. W drodze powrotnej Vesalius został najprawdopodobniej pozostawiony przez marynarzy, być może w chorobie, na greckiej wyspie Zakintos, należącej wówczas do Republiki Wenecji, gdzie wkrótce potem zmarł.
Zasługi Vesalius jako jeden z pierwszych odważył się na dokładne zbadanie zwłok ludzkich, wykazując przy tym liczne błędy w dziełach Galena, będące wynikiem nieuzasadnionego rzutowania stosunków anatomicznych zwierząt na organizację ciała ludzkiego. Wskutek tych poprawek i sprostowań popadł w spór ze swoim nauczycielem, Sylwiuszem, zwolennikiem Galena, a także innym sławnym badaczem – Eustachiuszem.