W filmie jest początkowo przedstawiona jako tajemnicza postać przejmująca kontrolę nad innymi, a jej rola nie została ujawniona przed premierą. Jacob Batalon jako Ned Leeds, były przyjaciel Parkera. Jon Bernthal jako Frank Castle / Punisher, bezwzględny mściciel, walczący ze zorganizowaną przestępczością. Michael Mando jako Mac Gargan / Scorpion, przestępca, który został schwytany przez Spider-Mana i aresztowany w filmie Spider-Man: Homecoming. Mark Ruffalo jako Bruce Banner / Hulk, genialny naukowiec, który w wyniku wypadku został napromieniowany, co zaowocowało niekontrolowanymi transformacjami w Hulka – wielkiego, humanoidalnego stwora o nadludzkiej sile i wytrzymałości. Mimo problemów z kontrolą nad swym alter ego, został on członkiem Avengers, a później zjednoczył oba aspekty swej osobowości.
Ponadto Marvin Jones III wciela się w postać Lonniego Lincolna / Tombstone’a, szefa mafii będącego albinosem, o niemal niezniszczalnej skórze i nadludzkiej sile, a w filmie grają także Liza Colón-Zayas, i Tramell Tillman.