Wzrost znaczenia państwa, a za tym i miasta, spowodował znaczący rozwój miejscowości, która osiągnęła ponad 5 tysięcy mieszkańców. W 1386 roku w Heidelbergu książę elektor Ruprecht I założył uniwersytet – najstarszy w granicach współczesnych Niemiec, trzeci najstarszy w granicach ówczesnego Cesarstwa i czwarty w Środkowej Europie (po praskim, krakowskim i wiedeńskim).
W XV wieku na skutek konfliktów miasto utraciło część swojego znaczenia. Dopiero czasy reformacji przyniosły nową dynamikę w jego rozwoju. Ponieważ ostatecznie elektorzy palatynatu przystąpili do wiary reformowanej – mało popularnej w Cesarstwie poza Szwajcarią i Holandią – byli oni zmuszeni do szukania sojuszy w odległych krajach Europy. Miasto, dzięki uniwersytetowi, stało się jednym z głównych ośrodków intelektualnych kalwinizmu. Zasłynęło z publikacji Katechizmu Heidelberskiego oraz bogatej Biblioteki Palatyńskiej () powstałej z księgozbiorów zrabowanych z likwidowanych klasztorów. Szczytem tej epoki był ślub księcia elektora Fryderyka V z królewną Elżbietą Stuart, córką króla Anglii.