Są to przede wszystkim: gajowiec żółty, szczyr trwały, szczawik zajęczy, miodunki oraz rzadko spotykana w okolicach Warszawy śledziennica skrętolistna.
Obszar rezerwatu jest miejscem bytowania wielu zwierząt. Spośród mniejszych ssaków można zaobserwować: lisa, borsuka, zająca, gronostaja, kunę, łasicę, ryjówkę, myszy i nornice. Dziuplaste drzewa są zamieszkiwane przez ptaki, ale również i nietoperze. Z powodu występowania na obszarze rezerwatu wielu starych drzew dziuplastych, jest to atrakcyjny teren dla ptaków. Występują tutaj: myszołów, czapla siwa, bażant, kowalik, dzięcioły, sikory, muchołówki, szpaki.
W wyniku badań i obserwacji stwierdzono, że w Lesie Natolińskim jest największe zagęszczenie dzięcioła średniego na Mazowszu.
Jest to także miejsce występowania wielu gatunków gadów, płazów i owadów.
Wśród owadów wyróżnia się jeden gatunek, objęty ochroną w ramach Europejskiej Sieci Natura 2000 – pachnica dębowa.
Rezerwat posiada naturalne walory krajobrazowe jak i kulturowe. W kierunku Wisły, przez cały rezerwat przebiega oś widokowa wschód-zachód. Stojąc na niej można zobaczyć pałac. Inne zabytkowe obiekty kulturowe to: Holendernia, akwedukty oraz pomnik Natalii.