Inicjacja W kolistych cząsteczkach DNA replikacja rozpoczyna się zawsze w tych samych miejscach inicjacji, o długości ok. 200–300 par nukleotydów. Miejsce to oznacza się skrótem ori (od ang. origins of replication). W liniowych chromosomach aktywnych przebiegać może wiele (tysiące) jednoczesnych procesów replikacji. Miejsca cząsteczek DNA, w których zachodzi replikacja, noszą nazwę replikonów (jednostka replikacji, zawiera miejsce rozpoczęcia i zakończenia procesu oraz wszystkie sekwencje fizyczne do niego przylegające, które są pod jego kontrolą i replikują razem z nim). Podwójna helisa DNA ulega rozwijaniu (odwinięciu od nukleosomów) i odsuwaniu się od siebie, następuje jej rozplatanie pod wpływem katalizującego działania enzymów: helikazy oraz topoizomerazy. Aby replikacja przebiegła prawidłowo, podczas rozdzielenia obu nici nie może dojść do zaburzenia ich struktury podstawowej (I-rzędowej). Muszą także zostać spełnione następujące warunki: matryca DNA musi zostać dokładnie odczytana dostępna musi być odpowiednia ilość wolnych nukleotydów podczas procesu musi zostać zachowana komplementarność nici (reguła komplementarności zasad). Powstałe po inicjacji widełki replikacyjne przesuwają się wzdłuż powielanej nici DNA.