dziećmi zajęła się jej siostra, Anna Katarzyna Zamojska. Śmierć matki niewątpliwie wywarła wpływ na osobowość przyszłego malarza. Jego dzieciństwo obfitowało w lęki i przykrości, nie zaznawał także raczej przesadnie starannej opieki (jego złamany nos nie zwrócił niczyjej uwagi i zrósł się krzywo). Ojciec nie okazywał dzieciom swoich uczuć, był surowy i pozbawiony akceptacji dla artystycznej pasji syna. Upodobania syna do rysunku traktował jako słabość. Brak rodzinnego ciepła po części rekompensowała Matejce przyjaźń z rodziną Giebułtowskich. O Paulinie Giebułtowskiej pisał później, że była dla niego jakby drugą matką. Często bywał u jej córki Joanny Serafińskiej w Wiśniczu, a Stanisław przez długie lata był jego najlepszym przyjacielem.
Od 1847 Jan Matejko uczęszczał do szkoły św. Barbary. Wkrótce został przeniesiony do Gimnazjum św. Anny (obecnie I Liceum Ogólnokształcące im. Bartłomieja Nowodworskiego w Krakowie). Mimo zdradzanych od najmłodszych lat niepospolitych zdolności plastycznych, z pozostałymi dziedzinami radził sobie z ogromnym trudem. Także koledzy nie byli dla niego wyrozumiali i, jak pisał Marian Gorzkowski, doświadczał od swych współtowarzyszy pewnego znęcania się nawet.