W obliczu zagrożenia wojennego w 1939 zwiększono liczbę łóżek w oddziałach szpitala oraz zbudowano kilkudziesięciometrową, jednotorową bocznicę tramwajową na jego dziedziniec, której fragment torów zachował się pod asfaltem w bramie.
Na początku kampanii wrześniowej 1939 część personelu została skierowana do organizacji szpitali polowych.
1939–1945 Po zajęciu Łodzi przez wojska niemieckie, szpital został przejęty przez Wehrmacht. Polski personel medyczny oraz hospitalizowani polscy żołnierze zostali przetransportowani do sąsiadujących budynków szkolnych przy ul. Pańskiej 115 (ob. ul. S. Żeromskiego), a następnie do obozu jenieckiego w Ostrzeszowie. Jednak jeszcze przez kilka pierwszych miesięcy 1940 niemieccy lekarze wojskowi leczyli w nim niewielką liczbę wymagających opieki jeńców polskich. Do stycznia 1945 szpital funkcjonował jako niemiecki wojskowy szpital rezerwowy (Reservelazarett). W czasie wojny szpital nie ucierpiał istotnie pod względem technicznym (Niemcy wywieźli jedynie urządzenia klimatyzacyjne).