Kilka lat później została wydana powtórnie za mąż za króla Manuela I Szczęśliwego, wuja Alfonsa i następcę Jana II. Ślub odbył się w 1497 roku w Valencia de Alcántara. Z powodu ciężkiej choroby brata Izabeli oraz dziedzica tronu Kastylii i Aragonii – Jana z Asturii, nieobecny na ślubie był Ferdynand Aragoński, który się nim opiekował. Informacje o śmierci dziedzica Izabela Kastylijska i Manuel otrzymali w trakcie ślubu, a Izabela z Asturii dowiedziała się o śmierci swojego brata dopiero po przyjeździe do Portugalii od swojego małżonka. Istnieje też inna wersja, w której Ferdynand dostał wiadomość o pogarszającym się stanie swojego syna w trakcie ceremonii ślubnych 4 października i wtedy wyruszył do Salamanki.
Po śmierci Jana i jego dziecka podczas porodu, Izabela wraz z Manuelem I wyruszyli 29 marca 1498 roku do Kastylii by zostać zaprzysiężonym na następców tronu Kastylii. Po przybyciu do Toledo zwołano kortezy, które nadały Izabeli tytuły księżnej Asturii i dziedziczki tronu Kastylii 29 kwietnia (wcześniej była nią przed narodzinami Jana).