Jones ponownie traci skarb, ale udaje mu się uciec do pozostawionego na rzece samolotu swojego przyjaciela.

Jakiś czas później Jones i jego przyjaciel, angielski muzealnik Marcus Brody, dowiadują się, że w Egipcie odnaleziono miejsce, w którym ponoć spoczywa biblijna Arka Przymierza. Szukają jej także niemieccy naziści, którzy dzięki jej nadnaturalnym właściwościom chcą zdobyć władzę nad światem. Archeolog otrzymuje misję uprzedzenia nazistów.

Jones rusza do Nepalu, by odnaleźć swoją dawną przyjaciółkę Marion Ravenwood, która odziedziczyła po zmarłym ojcu – byłym mentorze Indiany – medalion niezbędny do określenia dokładnego miejsca spoczynku Arki. Ta jednak nie zamierza mu pomagać, gdyż wiele lat wcześniej złamał jej serce. Nieoczekiwanie pojawia się oddział nazistów pod przywództwem agenta Gestapo – Arnolda Ernsta Tohta, który próbuje ukraść medalion. Dochodzi do konfrontacji Jonesa i Marion z nazistami w wyniku czego dom Marion staje w płomieniach. Podczas pożaru Toht dotyka rozgrzanego medalionu i parzy się, powodując tym samym odbicie kształtu i znaków medalionu na swojej dłoni. Indiana ratuje Marion, a ta po utracie majątku, postanawia mu towarzyszyć i wspólnie z nim odnaleźć Arkę.