Opierając się na rękopiśmiennym rodowodzie, znajdującym się w zbiorach rodzinnych Radziwiłów, w XIX w. Edward Kotłubaj za datę narodzin Barbary Radziwiłłówny uznał rok 1520Zygmunt Wdowiszewski, Genealogia Jagiellonów i Domu Wazów w Polsce, Kraków:Wydawnictwo Avalon, 2005, s. 149.. Jednakże w „De origine gentis Radiviliae” Salomon Rysiński wskazywał rok 1522Marceli Antoniewicz, Protoplaści książąt Radziwiłłów. Dzieje mitu i meandry historiografii, Warszawa:Wydawnictwo DiG, 2009, s. 241, 252., zaś metryczka przyszyta do sukni królowej, którą odkryto w 1931 r. podczas badań podziemi wileńskiej katedry, odnosiła się do roku 1523.

Małżeństwa 18 maja 1537 r. poślubiła w Gieranojach Stanisława Gasztołda, wojewodę nowogródzkiego, a potem trockiego, po czterech latach małżeństwa owdowiała. Na Stanisławie wygasł ród Gasztołdów. W myśl zasad prawa litewskiego po wygaśnięciu w linii męskiej rodu dobra przypadały wielkiemu księciu. Opiekun Barbary, jej brat, Mikołaj Rudy, zwrócił się o pomoc do królowej Bony (chodziło o możliwość korzystania chociaż z części dóbr ziemskich). W październiku 1543 r. nastąpiło wydarzenie, które zmieniło całe życie Barbary. Do Gieranojów przyjechał król Zygmunt August. Oficjalnym celem wizyty było załatwienie spraw spadkowych po Gasztołdach.