W 1555 r. został mianowany osobistym lekarzem arcyksięcia Ferdynanda, syna ówczesnego cesarza rzymsko-niemieckiego Ferdynanda I z dynastii Habsburgów. Przyjechał do Pragi, gdzie m.in. zajął się rozbudową ogrodów cesarskich, do których sprowadził wiele nieznanych tu wcześniej roślin (m.in. tulipany, narcyzy i hiacynty). Podczas wojny z Turcją w 1556 r. wraz z arcyksięciem przebywał na Węgrzech. Gdy Ferdynand I zmarł w 1564 r., Matthioli został nadwornym medykiem jego następcy, cesarza Maksymiliana II. Ostatnie lata swego życia Pierandrea Matthioli spędził w Innsbrucku i Weronie i – podobnie jak inny, współczesny mu botanik Alp, Konrad Gesner – zmarł na dżumę w styczniu lub lutym 1577 r. podczas pobytu w Trydencie.
Historycy nauki nie wystawiają Matthioliemu zbyt pochlebnej opinii jeśli idzie o cechy jego charakteru. Pracował szybko, lecz znacznie mniej dokładnie niż np. współczesny mu Gesner, niejednokrotnie niepotrzebnie przyspieszając edycję swych dzieł. Zyskując możnych mecenasów w osobach dwóch kolejnych cesarzy, Matthioli – nie umniejszając nic jego wiedzy – stał się zarozumiały i autorytarny.