Brescia i Ascoli Latem 2003 Di Biagio znalazł sobie nowy klub, którym była Brescia Calcio. Do gry w tym klubie namówił go jego kolega z Interu, Roberto Baggio i to obaj byli uważani za największe gwiazdy zespołu. W Brescii Luigi zadebiutował w 2. kolejce ligowej sezonu 2003/2004, 14 września w przegranym aż 0:5 meczu z Romą. Debiut nie był udany i Di Biagio zagrał słabo, a w przerwie meczu został zmieniony przez Andreę Caracciolo. W kolejnych meczach było już jednak lepiej i Brescia pod wodzą Giovanniego De Biasi zajęła 11. miejsce w lidze, a Di Biagio popisał się skutecznością zdobywając 7 goli w całym sezonie. Po sezonie, latem 2004 karierę zakończył Baggio i Brescia dużo straciła na sile ognia. Ciężar zdobywania bramek niespodziewanie padł na Di Biagio, który był najskuteczniejszym graczem zespołu – strzelił 9 goli – gdyż napastnicy Brescii spisywali się nadzwyczaj słabo. Ostatecznie trener Alberto Cavasin nie zdołał utrzymać zespołu w Serie A i ten zajmując przedostatnią pozycję został zdegradowany o klasę niżej. Pomimo tego Di Biagio sezon 2005/2006 spędził w Serie B, ale najlepsze lata miał już za sobą i rozegrał tylko 19 meczów i nie zdobył gola. Brescia zajmując 10. miejsce nie zdołała powrócić w szeregi pierwszoligowców.