Uzyskują ją dzięki enzymatycznej hydroksylacji atomów węgla w ich cząsteczkach i osiągnięciu postaci 1,25(OH)2D (1α,25-dihydroksywitamina D).
thumb|350px|Fotoizomeryzacja 7-dehydrocholesterolu do prewitaminy D thumb|350px|Izomeryzacja prewitaminy D do cholekalcyferolu (witaminy D3) thumb|350px|Hydroksylacja witaminy D3 do 1,25-(OH)2D3 (kalcytriol) Prowitaminą D2 jest ergosterol, a D3 – pochodna cholesterolu 7-dehydrocholesterol. W skórze, przede wszystkim w naskórku (głównie w keratynocytach warstwy rozrodczej), pod wpływem światła słonecznego 7-dehydrocholesterol ulega nieenzymatycznej fotoizomeryzacji do prewitaminy D, która pod działaniem energii cieplnej ciała przekształcona zostaje w ciągu kilku godzin w witaminę D3.
Przekształcenie prowitaminy w prewitaminę zachodzi pod wpływem promieniowania UV o długości 290–315 nm (zakres UV-B). Eksperymentalnie ustalono, że najbardziej efektywną długością fali świetlnej jest 295–300 nm (z maksimum efektywności przy 297 nm).
Nie ma niebezpieczeństwa powstawania toksycznych ilości witaminy D3 w wyniku nadmiernej ekspozycji na światło słoneczne, ponieważ w takiej sytuacji nadmiar prewitaminy i witaminy jest rozkładany.