Posiada on cztery mechaniczne macki. Rosemary Harris jako May Parker, ciotka Petera Parkera i wdowa po Benie Parkerze. Donna Murphy jako Rosalie Octavius, żona Otto Octaviusa i jego asystentka.
Swoje role z pierwszego filmu powtórzyli: Willem Dafoe jako Norman Osborn/Zielony Goblin, nieżyjący ojciec Harry’ego pojawiający się w halucynacjach syna; Cliff Robertson jako Ben Parker, zamordowany wujek Parkera; J.K. Simmons jako J. Jonah Jameson, redaktor naczelny Daily Bugle, który uważa Spider-Mana za kryminalistę; John Paxton jako Bernard Houseman, lokaj rodziny Osbornów; Elizabeth Banks jako Betty Brant, recepcjonistka w Daily Bugle; Ted Raimi jako Ted Hoffman i Bill Nunn jako Robbie Robertson, pracownicy Daily Bugle. W filmie ponadto wystąpili: Daniel Gillies jako John Jameson, syn J.J. Jamesona, astronauta i narzeczony Watson; Dylan Baker jako Curt Connors, profesor fizyki na uczelni Parkera i kolega Octaviusa, Elya Baskin jako pan Ditkovitch, właściciel, od którego Parker wynajmuje mieszkanie oraz Mageina Tovah jako Ursula, jego córka.
W roli cameo pojawił się Stan Lee, twórca komików Marvel Comics, który ratuje kobietę podczas walki Spider-Mana z Doktorem Octopusem.