W 1990 roku w użyciu w liniach lotniczych pozostawało 1700 samolotów, w 2000 roku – 1180. W kolejnej dekadzie większość z nich wycofano, częściowo na skutek kryzysu rynku lotniczego i wprowadzania bardziej ekonomicznych maszyn.
W sierpniu 2007 roku 620 Boeingów 727 było wciąż używanych. Główni operatorzy to: FedEx (95), United Parcel Service (33), Amerijet International (10), Astar Air Cargo (29), Capital Cargo International Airlines (13), Cargojet Airways (12), Champion Air (16), Custom Air Transport (17), Kelowna Flightcraft (15), Kitty Hawk Aircargo (26), Transafrik (11), Hewa Bora Airways (9), Lloyd Aereo Boliviano (9) i Transmile Air Services (9), Varig Log (8), Líneas Aéreas Suramericanas (8), Safair (7), Syrianair (6). Flight International. Inne linie lotnicze operowały nadal 104 Boeingami 727.
W czerwcu 2013 roku pozostawało eksploatowanych na świecie 180 Boeingów 727, w dużej części przez wojska lotnicze i agencje rządowe.
Firma Zero Gravity Corporation używa Boeingów 727, aby pokazać klientom jak wygląda stan nieważkości. Boeingów 727 używają także VIPy w Belgii i Meksyku. Wojsko Stanów Zjednoczonych używa Boeingów 727 do transportu wojskowego.