W grudniu 1545 poznał Georga Wisharta, wówczas niekwestionowanego przywódcę ruchu protestanckiego w Szkocji, odbywającego właśnie podróż misyjną po krainie Lothian. Spotkanie to dla obu miało doniosłe konsekwencje. Knox postanowił towarzyszyć kaznodziei i gdy w następnym roku Wisharta oskarżono o herezję i spalono na stosie, Knox stanął na czele ruchu reformacyjnego. Od tej pory ukrywał się.
Szkocja była wówczas pogrążona w religijnym chaosie i targana ostrymi konfliktami. Małżeństwo króla Jakuba V z Marią de Guise przyczyniło się do zacieśnienia stosunków między Szkocją i Francją, przy czym Francja popierała katolików. W 1547 wojska francuskie brały nawet udział w oblężeniu okupowanego przez protestantów zamku w St Andrews. Nieco wcześniej Knox, pod opieką którego pozostawało kilku pochodzących ze szlachty chłopców, ponaglany przez swych mocodawców, udał się na zamek, aby tam czuwać nad dalszą edukacją swych podopiecznych.
W efekcie, zarówno jego, jak i wielu innych, wzięto do niewoli i wywieziono na galery do Francji, skąd został zwolniony dopiero półtora roku później, po interwencji ze strony Anglii.