19 października 2006 publicznie ujawnił, że jest gejem, gdy Isaiah Washington, jego kolega z planu Chirurgów, wygłosił pod jego adresem homofobiczny komentarz. Kilka miesięcy później, w styczniu 2007 roku, powtórzył swoje słowa na konferencji prasowej po ceremonii rozdania Złotych Globów. Washington następnie wycofał swoje słowa, jednak został zwolniony z pracy pod koniec trzeciego sezonu serialu. W 2008 Knight poprosił producentów o zwolnienie go z kontraktu. Jego bohater, George O’Malley, przestał się pojawiać po szóstym sezonie. Swojego coming outu dokonał, wydając następujące oświadczenie w magazynie „People”: Przypuszczam, że było kilka pytań dotyczących mojej seksualności i chciałbym uciszyć niepotrzebne plotki, które się pojawiają. Chciałbym zachować swoje życie osobiste dla siebie, ale mam nadzieję, że fakt, że jestem gejem, nie jest najbardziej interesującą częścią mojej osoby.
W latach 2005–2006 spotykał się z aktorem Lukiem Macfarlanem. Od 2007 roku do października 2009 związany był z dziewiętnastoletnim studentem Markiem Cornelsonem.