W metropolii kijowskiej w XVI wieku zmiany terytorialne i jurysdykcyjne dotyczyły jedynie eparchii lwowskiej. Zainicjował je łaciński arcybiskup lwowski – Bernardyn Wilczek, który wystarał się u Zygmunta Starego o przywilej mianowania namiestnika prawosławnego metropolity kijowskiego w eparchii lwowskiej. Namiestnik miał zarządzać w imieniu metropolity. Został nim Makary (Tuczapski), który w 1539 roku uzyskał od króla nominację na eparchię halicko-lwowsko-kamieniecką i przeniósł stolicę biskupstwa do Lwowa. Zależność gospodarcza i prawna biskupów lwowskich od metropolity kijowskiego została zerwana dopiero pod koniec XVI wieku.
Źródła nie zawierają dokładnych danych o liczbie parafii prawosławnych na ziemiach polskich i litewskich w XVI wieku. Proces erygowania nowej parochii nie był uregulowany przepisami kanonicznymi, dlatego rozwój sieci parafialnej odbywał się spontanicznie. Większe zagęszczenie parochii było na Rusi koronnej, mniejsze – na północy Wielkiego Księstwa Litewskiego. Nowo powstała parafia była wizytowana przez biskupa, który poświęcał cerkiew i wyświęcał jej proboszcza. Rozwój sieci parafialnej został nieco zahamowany w drugiej połowie XVI wieku na skutek szerzenia się reformacji.