Uczelnia stała się miejscem kształcenia kadr nowo powstałego państwa – dominowali na niej studenci-Litwini (ponad 2/3 ogółu w 1929 roku), bardzo liczną grupę stanowili Żydzi (29%), inne mniejszości (Polacy, Rosjanie i Niemcy) reprezentowane były symbolicznie, co wynikało z prowadzonej przez rząd litewski polityki wspierania etnicznej ludności litewskiej, która na skutek długiej dominacji polskojęzycznych i niemieckojęzycznych elit była poszkodowana.
Związana z Uniwersytetem Akademia Rolnicza została powołana w 1924 roku na bazie Instytutu Agronomii i Leśnictwa Wydziału Matematyki i Nauk Ścisłych. W 1936 roku zdecydowano o powstaniu Akademii Weterynaryjnej na bazie Fakultetu Medycyny.
Rektorami uczelni w dwudziestoleciu międzywojennym byli kolejno: Jonas Šimkus, Vincas Čepinskis, Pranciškus Būčys, Petras Avižonis, Mykolas Biržiška, Michał Römer, Pranas Jodelė, po 1930 roku: Vincas Čepinskis, Michał Römer, Stasys Šalkauskis, Antanas Purėnas i Julijonas Gravgorkas (ostatni dwaj w latach 1940–1943).