XVI wiek to również okres formowania się wokół monasteru osady.

W XVI wieku monaster stał się ważnym ośrodkiem kulturalnym ziem ruskich. O jego znaczeniu świadczy fakt, iż w 1582 odwiedził go arcybiskup ochrydzki Gabriel, a w 1590 – patriarcha Jeremiasz II. Zakonnicy zgromadzili m.in. bogatą bibliotekę z cennymi drukami i rękopisami (np. Kodeks supraski z XI-XII w.).

W 1609 mnisi przystąpili do unii brzeskiej (1596), a klasztor w Supraślu stał się ważnym ośrodkiem kulturalnym i religijnym unitów. W 1695 uruchomiono przyklasztorną drukarnię, a w 1711 pierwszą we wschodniej Polsce papiernię. Tłoczono tu książki świeckie w języku łacińskim i polskim oraz książki religijne w języku cerkiewnosłowiańskim. Bazylianie zamalowali ruskie freski z XVI wieku i postawili wokół cerkwi nowe budynki.

W 1796 władze pruskie skonfiskowały większość dóbr klasztoru. W 1804 zlikwidowana została drukarnia. W 1807 Supraśl przestał być siedzibą biskupstwa unickiego, po pokoju w Tylży (1807) znalazł się pod zaborem rosyjskim.

Pod koniec XVIII w. w mieście wybudowano synagogę.

Mimo że w I połowie XIX w.