Pierwsza sesja obu izb odbyła się 6 kwietnia 1789 roku. W jej trakcie otworzono i policzono głosy oddane przez Kolegium Elektorów Stanów Zjednoczonych na prezydenta i wiceprezydenta Stanów Zjednoczonych. Wiceprezydent John Adams zgodnie z Konstytucją Stanów Zjednoczonych objął obowiązki przewodniczącego Senatu we wtorek 21 kwietnia.
Z kolei 15 maja zgodnie z trzecim paragrafem pierwszego artykułu Konstytucji Senat zadecydował poprzez losowanie o podziale senatorów na klasy. Senatorami 1. klasy, których kadencja wygasała 3 marca 1791 roku, wylosowano senatorów Carrolla, Daltona, Ellswortha, Elmera, Maclaya, Reada i Graysona. Senatorami 2. klasy, których kadencja wygasała 3 marca 1793 roku, wylosowano senatorów Bassetta, Butlera, Fewa, Lee, Stronga, Patersona i Wingate’a. Senatorami 3. klasy, których kadencja wygasała 3 marca 1795 roku, wylosowano senatorów Gunna, Henry’ego, Johnsona, Izarda, Langdona i Morrisa.
Od początku w obradach senatu uczestniczyli przedstawiciele dziesięciu stanów: Connecticut, Delaware, Georgii, Karoliny Południowej, Marylandu, Massachusetts, New Hampshire, New Jersey, Pensylwanii i Wirginii.