W związku z pełnieniem przez świątynię funkcji kościoła uniwersyteckiego – odbywały się tu nie tylko nabożeństwa, ale też i nieraz dysputy naukowe. Kościół św. Jana pozostawał w rękach jezuitów aż do kasaty zakonu w 1773 r. Budowla została przebudowana w latach 1825–1829 zgodnie z wytycznymi specjalnie powołanej komisji, którą kierował Karol Podczaszyński, dokonano zmian w stylu klasycystycznym, m.in. przebudowując fasadę świątyni. Zniszczono wówczas trzynaście ołtarzy, skuto stiuki oraz zamalowano freski. Rozebrano przylegającą do południowej elewacji barokową kaplicę, a od ulicy św. Jana dobudowano przedsionek.
Po zamknięciu uniwersytetu w 1832 r. kościół św. Jana nadal pełnił swoją funkcję sakralną, stając się jednocześnie miejscem uroczystości patriotycznych i swego rodzaju polskim panteonem narodowym. Dla upamiętnienia wielkich Polaków wzniesiono tutaj m.in. pomniki: Adama Mickiewicza, Władysława Syrokomli, Tadeusza Kościuszki, Stanisława Moniuszki, Antoniego Edwarda Odyńca. W miejscu zburzonych ołtarzy ustawiono posągi świętych, które pochodziły z zamkniętych kościołów św. Kazimierza, św. Ignacego i kościoła franciszkanów, przeniesiono tu również organy z kościoła jezuickiego w Połocku.