Jest niezbędny organizmom tlenowym do przeprowadzenia fosforylacji oksydacyjnej będącej najważniejszym etapem oddychania. Niektóre organizmy beztlenowe giną w obecności niewielkich ilości wolnego tlenu. Organizm przeciętnego dorosłego człowieka zużywa w ciągu minuty około 200 ml (0,3 g) tlenu. Oddychanie czystym tlenem jest dość niebezpieczne, ponieważ podnosi on ciśnienie krwi i wywołuje kwasicę. Niedobór tlenu staje się niebezpieczny dla życia, gdy jego zawartość w powietrzu spada poniżej 10–12%.
Zwierzęta wykorzystują go w procesie oddychania tlenowego w celu otrzymania energii:
Otrzymywanie w warunkach laboratoryjnych poprzez podgrzewanie nadmanganianu potasu w temperaturze powyżej 230 °C: poprzez termiczny rozkład azotanu potasu w temperaturze powyżej 400 °C, ale nie większej niż 440 °C: poprzez termiczny rozkład chloranu potasu w temperaturze powyżej 550 °C: poprzez ogrzewanie tlenku rtęci(II): poprzez rozkład wodnego roztworu nadtlenku wodoru (wody utlenionej lub perhydrolu) pod wpływem ciepła lub katalizatora, na przykład dwutlenku manganu: w wyniku reakcji nadmanganianu potasu z nadtlenkiem wodoru: w wyniku elektrolizy wody:
Zastosowanie Tlen jest stosowany w medycynie, do sporządzania mieszanek oddechowych do nurkowania, w przemyśle jako utleniacz (na przykład w palnikach acetylenowo-tlenowych).