Villegaignon pozyskał z własnej kieszeni trzeci okręt, zakupił broń, najął oddział Szkotów i zwerbował kolonistów wśród hugenotów i katolików, a także skazańców z Paryża i Rouen.
14 sierpnia 1555 roku Villegaignon wyruszył z Dieppe do Ameryki wraz z m.in. swoim kuzynem Bouvis de La Conti i kapelanem Andre Thevet. 6 listopada dotarł do Brazylii, a trzy dni później dopłynął do przylądka Frio. Na miejsce kolonii wybrał zatokę Rio de Janerio, gdzie założył kolonię France Antarctique, a na wyspie nazwanej potem jego imieniem założono fort Coligny.
Nicolas Durand de Villegaignon jako dowódca fortu wprowadził dość surowe zasady i żelazną dyscyplinę, odizolował kolonistów od Indian. Po pewnym czasie nasiliły się zatargi pomiędzy hugenotami i katolikami oraz coraz częstsze dezercje do Indian. W 1557 roku do kolonii przypłynęli kolejni kolonizatorzy, a wśród nich wielu kalwinistów i duchownych kalwińskich. Villegaignon, który sprzyjał kalwinistom, przyjął ich ochoczo, jednakże z powodu klęsk ich wojsk we Francji i zbliżającego się zwycięstwa katolików rok później wyrzucił ich z kolonii i odesłał do Francji. W 1559 roku powrócił do Francji, gdzie walczył z wojskami hugenotów.
Kolonia francuska w 1560 roku została zaatakowana przez portugalskiego gubernatora generalnego Mem de Sá, który zdobył ją.