W poniższych rozważaniach założono, że reakcje chemiczne nie są obiektem pomiarów, a przyczynkiem do fluktuacji jest dyfuzja translacyjna molekuł.

W FCS fluktuacje fluorescencji pochodzące od fluoryzujących molekuł służą do uzyskania informacji o dynamicznych procesach zachodzących na poziomie molekularnym. Fluktuacje są analizowane przy użyciu unormowanej funkcji autokorelacji która ma następującą postać:

dla otrzymuje się:

gdzie: – liczba fluoryzujących cząsteczek w objętości konfokalnej,

– objętość efektywna definiowana jako

oraz – rozmiary pomiarowej objętości konfokalnej w płaszczyźnie i wzdłuż osi tej objętości (wyznacza się je doświadczalnie na podstawie pomiaru funkcji autokorelacji dla wzorcowego barwnika o znanym współczynniku dyfuzji)

Zmierzona funkcja autokorelacji może teraz służyć do teoretycznego ustalenia i charakterystyki procesu, który wywołał fluktuacje. Funkcja autokorelacji opisuje dyfuzję translacyjną w elipsoidalnej objętości konfokalnej, przy założeniu, że czas zaniku fluorescencji i czas dyfuzji translacyjnej można dobrze separować w czasie.

Mierząc funkcję autokorelacji można zatem wyznaczyć czas dyfuzji znakowanej fluorescencyjnie cząsteczki.