Mechanizm działania Linezolid działa w początkowym etapie syntezy bakteryjnych białek. Uniemożliwia on łączenie jednostek 30S i 50S rybosomów. Linezolid wiąże podjednostkę 23S jednostki 50S w okolicach peptydylotransferazy (i miejsca z którym wiąże się chloramfenikol). W ten sposób hamuje jej współdziałanie z 30S. Działanie to jest bakteriostatyczne, jednakże obserwowano również efekt bakteriobójczy wobec paciorkowców.
Zastosowanie kliniczne Antybiotyk ten jest zarezerwowany do użycia jedynie w szczególnie ciężkich infekcjach bakteryjnych, w których leczenie starszymi grupami antybiotyków jest nieskuteczne (ze względu na nabytą oporność), często w zakażeniach szpitalnych.
Linezolid jest skuteczny przeciw bakteriom Gram-dodatnim (m.in. Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae i Streptococcus pyogenes). Nie działa zbyt skutecznie na bakterie Gram-ujemne. Działa na niektóre bakterie beztlenowe.