Na przykładzie powstawania jak dotąd najbardziej poznanego brassinosteroidu, czyli brassinolidu, wyróżniono trzy ścieżki prowadzące do powstania C27-, C28- i C29-pochodnych. Z kampesterolu w szeregu reakcji przekształcają się kolejno w kampastenol, katasterol, teasterol, tyfasterol, kastasteron (CS) i wreszcie brassinolid (BL). Przemiana kastasteronu do brassinolidu nie zachodzi jedynie u tytoniu szlachetnego Nicotiana tabacum i ryżu siewnego Oryza sativa. Każdy kolejny metabolit w szlaku biosyntezy ma aktywność większą niż jego poprzednik i tak CS ma właściwości słabsze od BL. Po raz pierwszy szlak syntezy został opisany przez badaczy japońskich, a następnie skorygowany przez analizę mutantów pod względem biosyntezy brassinosteroidów u rozdkiewnika pospolitego, pomidorów i grochu. Miejsce syntezy brassinosteroidów nie zostało doświadczalnie ustalone. Przyjmuje się hipotezę, że wszystkie tkanki roślinne są zdolne do syntezy BR, ale jedynie w niektórych z organów roślinnych dochodzi do ekspresji genów odpowiedzialnych za tworzenie łańcucha przekazywania sygnału. Hipotezę to potwierdzają obserwacje stosunkowo niewielkiego zasięgu działania hormonów z grupy brassinosteroidów.