Aleksandra Newskiego, urządzona w tym samym roku w kaplicy Pałacu Branickich.
Po rezygnacji z przekształcenia pałacu w carską rezydencję, podjęto decyzję o budowie wolno stojącej, murowanej cerkwi pod wezwaniem patrona parafii – św. Mikołaja. Cerkiew św. Aleksandra Newskiego miała pełnić odtąd tylko funkcję wewnętrznej świątyni pałacu (w którym urządzono Instytut Dobrze Urodzonych Panien). XVIII-wieczną drewnianą cerkiew św. Mikołaja rozebrano ze względu na jej szczupłośćPo likwidacji unii na Białostocczyźnie (1839) liczba prawosławnych w mieście znacznie się zwiększyła. i zły stan techniczny. Nową świątynię parafialną wzniesiono w latach 1843–1846.
Decyzją Jego Ekscelencji, Arcybiskupa Białostockiego i Gdańskiego Sawy, w 1983 wyłączono z parafii św. Mikołaja nowe parafie: Świętego Ducha na Antoniuku, Wszystkich Świętych na Wygodzie a później Hagia Sophia na Jaroszówce, Zmartwychwstania Pańskiego na Słonecznym Stoku oraz św. Jerzego na Nowym Mieście.
Doniosłym wydarzeniem dla parafii była wizyta w 1987 Jego Świątobliwości Patriarchy Ekumenicznego Konstantynopola Dimitriosa I oraz w 1991 Papieża Jana Pawła II. W 1988 w soborze św.