Od założenia aż do 1945 roku Zakład Narodowy im. Ossolińskich mieścił się w dawnym klasztorze i kościele ss. karmelitanek trzewiczkowych przy ul. Ossolińskich 2 we Lwowie. Po I rozbiorze Polski i kasacie wielu klasztorów przez cesarza Józefa II budynek klasztoru i kościoła był w stanie ruiny. Jego restauracja była dziełem m.in. Józefa Bema i Jerzego Głogowskiego – budowniczego, malarza i grafika, który do Lwowa przybył z Krakowa. Do Zakładu jako odrębną całość przyłączono w 1823 roku Muzeum ks. Lubomirskich, założone przez księcia Henryka Lubomirskiego.
Ossolineum w czasie istnienia ówczesnej Galicji pod zaborem austriackim skupiało polski ruch umysłowy i było jednym z najważniejszych ośrodków pracy nad budową kultury polskiej w czasie zaborów i narzuconej germanizacji. Przeszło w tym czasie okres prześladowań w postaci rewizji policyjnych oraz aresztowań zatrudnionych tam pracowników.
W myśl intencji założyciela stało się ono jednym z najważniejszych ośrodków badań nad dziejami i literaturą polską, tym bardziej że rozporządza jednym z największych księgozbiorów w Polsce, a także ogromnym zbiorem rękopisów i autografów, w tym rękopisów średniowiecznych i najstarszych druków.