Po obejrzeniu kaplicy Caravaggio zaproponował zastąpienie zamówionych kompozycji naściennych obrazami na płótnie. Miało to związek z faktem, iż kaplica mimo prowadzonych w niej prac miała pozostać czynna i ustawianie w niej rusztowań na potrzeby pracy malarskiej mogło poważnie utrudnić korzystanie z niej. Rozwiązanie tego rodzaju nie miało precedensu, jednak koncepcja Caravaggia została przyjęta. Artysta traktował zamówienie bardzo prestiżowo. Badania płótna promieniami Rentgena, przeprowadzone przez Lionela Venturiego, wykazały, że autor długo nie mógł zdecydować się na ostateczny kształt kompozycji, kilkakrotnie dokonując jej poważnych zmian.
Opis Obraz przedstawia śmierć św. Mateusza zgodnie z legendą, według której święty został zamordowany przy ołtarzu przez oprawców nasłanych przez króla etiopskiego, któremu Mateusz uniemożliwił uwiedzenie jego krewnej – zakonnicy. W centralnym punkcie kompozycji Caravaggio umieścił leżącego na ziemi świętego w szatach kapłańskich, którego przytrzymuje za prawą rękę oprawca z mieczem w dłoni. Po obydwu stronach sceny męczeństwa widoczni są przerażeni świadkowie śmierci Mateusza, którzy, dramatycznie gestykulując, odsuwają się od zabójcy. Jedna z postaci w tle ma rysy twarzy samego Caravaggia.