6 stycznia 1989 Jan Paweł II (z współkonsekratorami, arcybiskupami: Edwardem Cassidym i José Sánchezem) udzielił mu święceń biskupich w bazylice św. Piotra. 7 grudnia 1995 został mianowany nuncjuszem apostolskim w Republice Federalnej Niemiec, a 7 października 2003 – sekretarzem ds. relacji z państwami Sekretariatu Stanu (faktycznym szefem dyplomacji), zastąpił mianowanego kardynałem Jeana-Louisa Taurana.
W czerwcu 2006 papież Benedykt XVI nominował go na prezydenta Papieskiej Komisji Państwa Watykańskiego w miejsce odchodzącego na emeryturę kardynała Edmunda Szoki. Objęcie urzędu nastąpiło w połowie września 2006, a następcą arcybiskupa Lajolo w Sekretariacie Stanu został Dominique Mamberti. We wrześniu 2004 i 2006 reprezentował Stolicę Apostolską na forum Zgromadzenia Ogólnego Narodów Zjednoczonych. Tę funkcję pełnił od 15 września 2006.
Na konsystorzu 24 listopada 2007 został włączony do grona kardynałów z nominacji Benedykta XVI.
3 września 2011 rezygnacja z urzędu Prezydent Gubernatoratu Państwa Watykańskiego została przyjęta. Jego następcą został Giuseppe Bertello, który objął urząd 1 października 2011.