uric acid transporter).
thumb|center|600px|Mechanizm działania pirazynamidu
Aktywność przeciwbakteryjna Pirazynamid jest aktywny jedynie wobec Mycobacterium tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, ale nie wobec M. bovis). MIC (najmniejsze stężenie hamujące) dla bakterii wrażliwych wynosi 5,25-50 μg/ml (przy pH 5,5), podczas gdy Escherichia coli lub Mycobacterium smegmatis są niewrażliwe na stężenia leku przekraczające 2000 μg/ml przy tym samym pH. W zależności od stężenia pirazynamidu we krwi (do 1000 μg/ml), zabiciu ulega maksymalnie 72% populacji bakterii. W badaniach in vitro wykazano długi, utrzymujący się ponad 76 dni, efekt poantybiotykowy pirazynamidu. Pirazynamid wykazuje synergizm z klarytromycyną wobec M. tuberculosis.
Oporność Niewrażliwość na pirazynamid (ale nie na kwas pirazynowy) wiąże się w głównej mierze ze spadkiem aktywności pirazynamidazy i powoduje wystąpienie oporności krzyżowej na nikotynamid, ale nie na inne leki przeciwgruźlicze. Wiąże się to z mutacją w genie pcnA kodującym wspomniany enzym. Naturalna oporność na pirazynamid (np. u M. bovis) wiąże się z mutacją punktową w genie pcnA, gdzie w pozycji 169 cytozyna zastąpiona jest guaniną. Powoduje to zmianę aminokwasu w pirazynamidazie, z histydyny na kwas asparaginowy, w pozycji 57.