Rozgrywka 200px|thumb|left|Cezar Borgia Rozgrywka w Brotherhood jest podobna do sposobu gry znanej z poprzednich części serii, jednak w nowej części twórcy wprowadzili wiele ulepszeń i zmian. Akcja gry dzieje się w XVI-wiecznym Rzymie, czyli głównej siedzibie wrogów asasynów – templariuszy. W przeciwieństwie do poprzednich części serii, otwarty świat gry jest ograniczony do jednego miasta – Rzymu, ale jego obszar jest aż trzy raz większy niż Florencja z Assassin’s Creed 2. Ponadto Brotherhood zawiera szereg liniowych misji, które przenoszą gracza na tereny inne niż Rzym. Podczas zabawy spotkamy postaci znane z poprzedniej części gry, takie jak Leonardo Da Vinci, Niccolò Machiavelli czy Caterina Sforza. Naszym głównym celem jest Cezar Borgia. Kampania dla jednego gracza trwa około 15 godzin. Jedną z ważniejszych nowości jest wprowadzenie systemu zarządzania bractwem asasynów i korzystania z ich pomocy podczas misji. Od momentu uzyskania pierwszych rekrutów Ezio może wezwać asasynów do pomocy w prawie każdej chwili gry. Ulepszeniu uległ także ekwipunek Ezio – podczas wykonywania misji gracze mogą użyć kuszy, zatrutej strzałki, a nawet spadochronu. Asasyn w specjalnych misjach maszyn wojennych Leonarda kieruje ponadto różnymi machinami, jak np.