W związku z tym, że Elżbieta była wnuczką Władysława II Jagiellończyka, brata Zygmunta I Starego, papież Paweł III musiał udzielić dyspensy ślubnej. Ślub 17-letniej Elżbiety z 23-letnim Zygmuntem odbył się 6 maja 1543 roku na Wawelu. Bona Sforza była niechętna małżeństwu syna, ponieważ nienawidziła Habsburgów.
Małżeństwo nie było szczęśliwe. Młoda, niedoświadczona, nieśmiała i mało błyskotliwa Elżbieta nie pociągała króla. Sytuację pogarszała nieuleczalna choroba młodej królowej, epilepsja, co do reszty odstręczyło od niej małżonka. Przez cały okres trwania małżeństwa Zygmunt zdradzał żonę m.in. z Barbarą Radziwiłłówną. Jednocześnie Bona jawnie okazywała synowej swą niechęć. Jedyną osobą, okazującą Elżbiecie sympatię, był król Zygmunt I Stary. Jesienią 1544 Elżbieta wraz z Zygmuntem II Augustem wyjechała na Litwę. Małżonkowie zamieszkali w Wilnie. Przez krótki czas król stwarzał pozory w miarę poprawnego pożycia z małżonką. W rzeczywistości był już mocno zaangażowany w romans z Barbarą Radziwiłłówną.