Studiował medycynę na Uniwersytecie w Tartu (Dorpat) w latach 1832–1835. Dyplom uzyskał w 1837 roku, następnie podjął dalsze studia w Berlinie, Erlangen, Wiedniu i Wrocławiu. W 1839 podjął pracę na uniwersytecie w Kijowie.
Istotna zmiana nastąpiła, gdy w jego życiu pojawił się Karl Ernst von Baer, który organizował ekspedycję badawczą do Laponii i na Półwysep Kolski. Middendorff wziął w niej udział i była to pierwsza z szeregu ekspedycji, które naznaczyły jego życie. Najbardziej w nauce znaną jest tzw. „Wielka Ekspedycja Syberyjska” (czasem też: „Ekspedycja Middendorffa”) w latach 1843–1845, która dotarła na północy aż do Półwyspu Tajmyr, a na wschodzie – poprzez tereny nad jeziorem Bajkał – aż po Amur.
W 1852 r. Middendorff został wybrany na członka Petersburskiej Akademii Nauk (w klasie zoologicznej). Wkrótce jednak, bo w 1860 r., opuścił Petersburg. Pomimo jednak wyjazdu z Rosji nadal utrzymywał kontakty z uczonymi rosyjskimi i brał udział w kolejnych ekspedycjach, np. na trasie Krym – Turcja – Grecja – Malta – Wyspy Kanaryjskie. Podróżował też na trasie Ural – Azja Środkowa – Azja Południowa. W 1870 r. na zaproszenie jednego z książąt rosyjskich przyłączył się do wyprawy idącej z Rosji północnej poprzez wyspy Nowa Ziemia do Islandii. W osiem lat później pojechał wraz z synem Maxem do Fergany.