W 1562 wybuchła we Francji wojna domowa o podłożu religijnym. Coligny niechętnie przyłączył się do walki. W lutym 1563, gdy został zamordowany Franciszek de Guise, wdowa po nim, Anna d’Este, szukała możliwości pozwania de Coligny'ego, bo uważała go za odpowiedzialnego za śmierć męża. W ciągu następnych 3 lat wnosiła petycje do króla i pozwy sądowe. W styczniu 1566 rada królewska uznała oskarżonego niewinnym.
Po śmierci księcia Condé stał się głównym przywódcą hugenotów. Pomimo klęski pod Moncontour (1569) udało mu się odtworzyć armię protestancką na południu kraju i dojść z nią do górnego odcinka Sekwany. Dzięki temu hugenotom udało się doprowadzić do zawarcia korzystnego dla nich porozumienia pokojowego w Saint-Germain (1570).
W 1571 Coligny wraca na dwór królewski i zaczyna wywierać coraz większy wpływ na króla Karola IX. Zaczął planować użycie połączonej armii francuskich katolików i hugenotów przeciwko Hiszpanii w zbuntowanych Niderlandach. Sukces odniesiony przez protestantów poza granicami Francji miał wzmocnić ich pozycję w tym kraju m.in. poprzez osłabienie katolickiej Hiszpanii i wyparcie jej z północnej Europy. Oprócz tego Coligny dzięki pokonaniu Hiszpanii liczył na szczególne względy króla.