Po ukończeniu nauki uniwersyteckiej (1858) Lombroso rozpoczął praktykę medyczną, prowadząc jednocześnie badania nad kretynizmem i pelagrą – chorobami endemicznymi w Lombardii. W 1859 ogłosił rozprawę doktorską pt. Ricerche sul cretinismo in Lombardia. Następnie zaciągnął się do wojska i służył pod Garibaldim. Po czterech latach osiągnął stanowisko lekarza.
Służba w wojsku umożliwiła mu systematyczne badania na dużych próbach badawczych. Lombroso zauważył również zjawisko tatuażu, opisane później w odrębnej pracy i będące źródłem jego zainteresowań kryminologią. Przeprowadził też badania antropometryczne na 3000 żołnierzy i zestawił wyniki z badaniami nad ludnością różnych rejonów Włoch.
Po odejściu z wojska rozpoczął pracę jako psychiatra w szpitalach w Pawii, Pesaro i Reggio nell’Emilia (1863–1872). Zaczął też publikować swoje dojrzałe prace na temat chorób psychicznych. W 1869 ożenił się. W małżeństwie miał dwójkę dzieci: Paolę i Ginę. Z mężem Giny, Guglielmo Ferrero, napisał później jedną ze swoich prac (Kobieta jako zbrodniarka i prostytutka). Od 1871 Lombroso zaczął równocześnie pracować jako dyrektor zakładu dla obłąkanych w Pesaro.