Celem takiego założenia była nie tylko ekspozycja roślin, lecz także nauka botaniki, promowanie ekspedycji służących odkrywaniu nowych gatunków (szczególnie w hiszpańskich posiadłościach kolonialnych) i ich klasyfikacji. Kolekcja ogrodu wzbogaciła się znacznie w 1794 r., gdy za sprawą Alessandro Malaspiny pojawiła się w nim kolekcja 10 000 nowych roślin. Zgromadzone okazy żywe oraz szkice i zielniki spowodowały, że w początku XIX w. Królewski Ogród Botaniczny w Madrycie był jednym z najważniejszych w Europie.
Ogród został opuszczony w wyniku wojny o niepodległość (1808 r.), lecz w 1857 r. podjęto kroki zmierzające do rewitalizacji: zbudowano szklarnię i odświeżono górny taras, wkrótce także zorganizowano ogród zoologiczny, później przeniesiony do Parque del Buen Retiro. Koniec XIX w. przyniósł ogrodowi kolejne straty: ograniczenie jego powierzchni (na wydzielonej w ten sposób działce zbudowano dzisiejszą siedzibę Ministerstwa Rolnictwa), a także utrata części drzew w wyniku poważnej wichury. W 1974 r., po latach zaniedbań, ogród został zamknięty i poddany renowacji. Otwarto go ponownie w 1981 r. W 2005 r. powiększono jego powierzchnię o dodatkowy hektar.