Kolekcja składała się tylko ze 112 obrazów, w tym 39 zakupionych w Rzymie w roku 1856 i 30 wypożyczonych z innych placówek, w tym z londyńskiej National Gallery.
Mniej więcej w tym samym czasie Henry Vaughan przekazał na rzecz nowo otwartej galerii kolekcję akwarel Williama Turnera z zastrzeżeniem, iż ma ona być eksponowana tylko w styczniu, a to w celu zabezpieczenia jej przed niszczącym wpływem światła słonecznego. Pomimo iż dzisiejsza technologia niweluje ten wpływ, National Gallery nadal stosuje się do zaleceń Vaughana.
W 1866 r. ustanowiona została roczna dotacja w wysokości 1000 funtów na zakup obrazów. Nowo powstała instytucja budowała swoje zbiory nie tylko w drodze zakupu, ale też zapisów i darowizn.
XX i XXI w. W 1901 roku hrabina Milltown przekazała galerii w darze ze swego domu w Russborough ponad 200 obrazów, a także kolekcję sreber, mebli oraz książek z własnej biblioteki. Wielkość tego daru spowodowała konieczność rozbudowy galerii. Po darowiźnie hrabiny Milltown nastąpiły kolejne zapisy i darowizny, którym National Gallery zawdzięcza swój obecny stan posiadania. Istotną darowizną było przekazanie przez kolekcjonera Hugh Lane’a dużego zbioru obrazów i ustanowienie fundacji Lane Fund, dzięki której National Gallery dokonuje zakupu dzieł sztuki aż do dziś.