Jego pierwszą samodzielną pracą, po rozprawie doktorskiej, była analiza treściowa napisów na nadstawkach i przykryciach waz kyreńskich.
W latach 1881/83 otrzymał stypendium z Niemieckiego Instytutu Archeologicznego na badania. W latach 1882-1883 wraz z Carlem Hummanem badał tumulusy i hierotheseion (hierotezjon) Antiocha na górze Nemrut, leżącej na obszarze dawnego królestwa Kommagene. W 1896 roku został profesorem i wykładowcą Archeologii Klasycznej we Freiburgu (1905/11), a następnie sekretarzem generalnym Niemieckiego Instytutu Archeologicznego w Berlinie. Puchstein wspólnie z Robertem Koldeweyem prowadził wykopaliska na południu Włoch i na Sycylii, gdzie pracował w Baalbek, Palmyra, w Nemrut Dagi i w Hattusa, a towarzyszył mu jako fotograf w 1905 r. jego bratanek Erich Puchstein. Był współzałożycielem Muzeum Pergamońskiego w Berlinie i Ołtarza Pergamońskiego.