W 1918 roku zbiory biblioteki objęto nadzorem państwowym nowo-powstałej Czechosłowacji. W 1924 utworzono bibliotekę słowiańską, która od 1929 roku znajduje się również w gmachu Clementium. W 1935 roku biblioteka została przemianowana na Bibliotekę Narodową i Uniwersytecką, wprowadzono również obowiązek dla wydawców przekazywania zawsze jednego egzemplarza wydawanego dzieła do zbiorów biblioteki. Po zajęciu Czechosłowacji przez III Rzeszę, biblioteka została przemianowana na Bibliotekę Miejską i Uniwersytecką (cz. Zemská a univerzitní knihovna). W 1958 roku bibliotekę połączono ze zbiorami innych praskich bibliotek w Narodową Bibliotekę Czechosłowacji. W roku 1990 biblioteka otrzymała swoją obecną nazwę.
W 2005 roku Biblioteka Narodowa Republiki Czeskiej otrzymała nagrodę Jikji dla instytucji i osób prywatnych, które najlepiej realizują cele projektu UNESCO Pamięć Świata.
Zbiory Biblioteka posiada kolekcje kodeksów średniowiecznych podarowanych przez króla czeskiego Karola I uniwersytetowi w Pradze w 1366 roku. Zbiory manuskryptów obejmują m.in. kodeks wyszehradzki z końca XI wieku, martyrologium Kunegundy – opatki klasztoru św.