Zmodyfikował założenia Younga, przyjmując, że powstawanie różnych wrażeń barwnych jest efektem trzech niezależnych procesów fotochemicznych zachodzących w „substancji nerwowej” pod wpływem promieniowania, z udziałem trzech rodzajów światłoczułych receptorów, których reaktywność jest zależna od długości fali (λ) padającego światła – największa wówczas, gdy λ odpowiada barwom podstawowym: czerwonej, zielonej i fioletowej. Wyniki zostały opublikowane w roku 1860 w pracy Handbuch der physiologischen Optik (podręcznik optyki fizjologicznej). Poza rozwinięciem teorii Younga Helmholtz zdefiniował trzy – do dzisiaj stosowane – cechy otrzymywanych barw: jasność (jaskrawość), odcień (ton barwy) i nasycenie (czystość) oraz wyjaśnił różnice między subtraktywnym i addytywnym mieszaniem barw.
Kontynuacja badań Younga i Helmholtza
Dalszy szybki rozwój teorii trójchromatycznej nastąpił dzięki rozwojowi biochemii i neurofizjologii, w tym neurofizjologii wzroku, który nastąpił w XX w. Badania w tych dziedzinach prowadzili m.in. laureaci Nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny: 1963 – sir John Carew Eccles, Alan Lloyd Hodgkin i Andrew F.