W 2000 roku zainteresował się komunikacją natychmiastową (ang. Instant Messaging, (IM)) i rozpoczął pracę nad komunikatorem internetowym. Razem z Evanem Williamsem i Christopherem Stone'em rozwinął swój pomysł i zbudował prototyp platformy Twittera. Dorsey wysłał pierwszą wiadomość – tweet 21 Marca 2006 roku. Wkrótce ich serwis społecznościowy udostępniający usługę mikroblogowania zdobył wielką popularność jako medium społecznościowe i narzędzie natychmiastowej dystrybucji wiadomości.
Dorsey pełnił funkcje dyrektora generalnego (CEO) Twitter, Inc. do 2008 roku, po czym został przewodniczącym rady nadzorczej przedsiębiorstwa.
W 2009 roku został współzałożycielem firmy Square, Inc. (obecnie Block, Inc.) z sektora płatności mobilnych zajmującej się produkcją sprzętu i oprogramowania ułatwiającego transakcje kartami kredytowymi. Dorsey objął stanowisko dyrektora generalnego firmy.
W 2015 roku Dorsey ponownie został dyrektorem generalnym Twitter, Inc., rezygnując z funkcji przewodniczącego rady nadzorczej.
Dorsey ogłosił swoje odejście z Twitter, Inc. 29 listopada 2021 roku.