W 1542 papież Paweł III utworzył w Rzymie Świętą Kongregację Rzymskiej i Powszechnej Inkwizycji (Święte Oficjum), jako nadrzędny trybunał inkwizycyjny koordynujący działalność lokalnych trybunałów w Italii. Piętnaście lat później Republika Sieny ostatecznie weszła w skład Wielkiego Księstwa Toskanii pod rządami dynastii Medyceuszy. W 1560 w stolicy księstwa Florencji utworzona została stała nuncjatura apostolska, która była odtąd pośrednikiem między lokalnymi inkwizytorami a Kongregacją Świętego Oficjum. W 1569 Kongregacja przejęła z rąk władz zakonu franciszkanów prawo nominacji inkwizytorów Sieny. Pierwszym inkwizytorem mianowanym przez Kongregację został Pietro Giusti da SarnoWadding, Annales Minorum 1565–1574, s. 230..
Niewiele wiadomo o aktywności sieneńskiego trybunału przed 1580. W 1569 pięć domniemanych czarownic zostało spalonych na stosie z wyroku inkwizycji. W późniejszym okresie najwięcej spraw dotyczyło praktyk magicznych i czarów, jednak po 1588 nie zapadały już wyroki śmierci. Okres największej aktywności trybunału sieneńskiego przypadł dopiero na pierwszą połowę XVIII wieku. Zachowana dokumentacja wskazuje na bardzo silne związki trybunału z Kongregacją Świętego Oficjum w Rzymie, z którą konsultowano wszystkie istotne działania.